近期，小核酸赛道频频传来动辄十亿美金以上的商业交易，资本市场上的活跃也带动着学术界的研究热情。北大生科院团队在Trends in Molecular Medicine发表了关于siRNA药物发展的三大挑战和策略，为科学界和药学界提供了有价值的指导。 

siRNA药物研究最关键的三大瓶颈

尽管siRNA药物在临床中的应用前景广阔，但其开发面临着关键性的挑战：靶向积累和细胞摄取（Entry）、内吞体和溶酶体逃逸（Escape）、以及体内药物性能（Efficacy）（三个“E”挑战）。

1.1“Entry”挑战：靶向积累和细胞摄取

首先面临的挑战是siRNA有效富集于靶器官/组织中，接着有效内化到靶细胞中（图1）。siRNA在体内面临着清除的风险：

①纳米载体封装的siRNA通常与血清蛋白结合，随后被网状内皮系统（RES）摄取和吞噬清除；

②siRNA可以被血浆、组织和细胞质中的核酸酶或磷酸酶快速降解。

③siRNA无法到达靶细胞：siRNA必须穿过毛细血管内皮进入靶组织，但由于广泛的粘附和紧密连接，以及有效的交叉屏障、血脑屏障（BBB）和血视网膜屏障，siRNA到达靶细胞困难重重。

④此外，在实体肿瘤中，由于增强的渗透性和滞留性（EPR）效应，siRNA还可能被动地积累在肝脏或肿瘤组织中。

图1：siRNA通过血管、肝脏和肾脏等器官的清除，并积聚在肝脏和肿瘤中

1.2“Escape”挑战：从内吞体和溶酶体中逃逸

第二个挑战是如何逃脱内吞体和溶酶体。虽然siRNA可以通过内吞作用进入细胞，但只有不到1%的siRNA可以从内吞体逃逸，被动siRNA逃逸率小于0.01%。

唾液糖蛋白受体（ASGPR）是一个明显的例外，肝细胞表达水平约为50万或更高，循环时间小于20 min。过量的GalNAc-siRNA偶联物可以在肝细胞的细胞质中积累，以达到治疗水平。这给未来基于RNA靶向的肝脏治疗带来了希望。

对于其他类型的细胞来说，siRNA如何逃逸仍然是一个未解决的问题。大多数表面受体的表达范围为10000-100000或更少，受体的循环时间90 min及以上（图2B）。由于siRNA在细胞质和内吞体中的降解，研究者观察到在任何给定时刻，只有少量的GalNAc-siRNA偶联物存在于细胞质中。因此，虽然内吞RNA治疗剂像仓库一样，可以维持较长的单剂量反应时间，但大量内吞RNA治疗剂无法穿透细胞质，也就无法起效。当然，也不要一味的追求内吞体的释放，需要有一种平衡来维持释放和储存，确保在较长时间内持续产生反应。

图2：与ASGPR(~ 10⁶/肝细胞)介导的GalNAc偶联物相比，非肝细胞表面受体的表达水平有限（~ 10⁴-10⁵），靶向这些受体的药物在细胞内的含量明显降低。

1.3“Efficacy”挑战：体内药物性能

第三个挑战是siRNA在体内需要良好的稳定性、持久的效果和安全性。

交付系统存在副作用风险。使用病毒载体在体内传递核酸具有一定的毒副作用，目前主要局限于临床前研究。临床上主要使用化学合成的载体系统，如阳离子脂质和大多数无机纳米颗粒，但也有诱导细胞凋亡和炎症的风险。另外，在生物体内进行的交付系统还必须确保易于生产、质量控制和运输，以便实现大规模临床应用。

尚未建立RNA药物的临床前毒性评价模型。由于非灵长类动物（NHP）与人类基因组序列的重叠有限，因此从小鼠模型中获得的RNA药物剂量-反应关系不能直接应用于人类，也就无法预测药效。或许可以扩大对非人灵长类动物的使用模型，或选择与疾病相关的类器官作为评价模型。

此外，外源性寡核苷酸可能表现出免疫原性，引起免疫反应。随着技术的突破，化学修饰已经被广泛地应用于提高siRNA的性能，如增强siRNA的稳定性，减少/消除脱靶效应和免疫原性等。尽管化学修饰取得成效，能够低剂量长效沉默基因（图3C），然而挑战仍然存在，例如脱靶诱导毒性（图3D）。

因此，siRNA药物的毒性和免疫原性在临床前和临床研究中都需要仔细评估。

图3：（C）在ORION-10试验中，PCSK9水平随时间的百分比变化。（D）siRNA的特异性弱导致脱靶效应。

如何克服这三个“E”挑战？

为了应对这些挑战并推进siRNA疗法的发展，下面分享4个值得探索的策略。

2.1 开发新的化学改性方法

优化化学修饰能够提高siRNA的稳定性、特异性、安全性和生物利用度。这包括开发新的化学改性单体、修饰模式和RNAi触发结构（图4）。

传统siRNA修饰主要包括2’-O-甲基化、2’-flu-脱氧核糖核酸和PS，而新的修饰单体和修饰模式的发展将会进一步控制siRNA的药代动力学和安全性。例如，新的单体，如乙二醇核酸和5′-(E)-乙烯基膦酸盐（图4B）；新的修饰模式，如增强化学稳定性的ESC+（图4A）；以及新的RNAi触发结构，如小环状干扰RNA（sciRNAs）、不对称siRNA和二价siRNA支架（图4C）。

此外，siRNA的设计和修改现在可以使用算法来实现。例如，Alnylam已经开发了几代siRNA设计，包括部分siRNA改良的、标准模板化学（STC）、ESC、高级ESC、ESC+和IKARIATM，目前几种ESC+偶联物正在临床管道中使用。在专利方面，新入局者通过发展新的单体、模式和结构能够绕过现有的知识产权。此外，商业合作期间的公开许可协议可以为其他公司提供使用siRNA技术的机会，促进其推广和商业化。

图4：（A）Parsiran的序列和修饰细节，以及Alnylam、Arrowhead、Silence和Dicerna等具有代表性的siRNA修饰模式。（B）常用于（A）的修饰单体和N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）连接体结构。（C）一些新的RNAi触发结构，包括小环状干扰RNA（sciRNA）、GEMINIm、mxRNAm、不对称siRNA、细胞穿透不对称siRNA（cp-asiRNA）和二价siRNA（di-siRNA）支架。

2.2 建立独特的配送体系

目前，已经有各种纳米材料被开发为siRNA载体，如LNPs、聚合物、无机纳米颗粒和外泌体，但负载能力、稳定性、安全性和性能仍有局限性。

未来的基础研究应侧重于优化这些载体的理化性质，并利用独特的靶向配体或化学基团特异性结合病变细胞表面标记物/受体。不同于纳米颗粒，siRNA可以与配体共价连接，形成配体-siRNA偶联物，能够降低循环中的清除率，增强靶向积累和细胞摄取，从而调节其药代动力学和药效学试剂。这些配体包括小分子、脂质、多肽、配体、抗体、蛋白质、糖类和非编码RNA（ncRNA）（图5）。 

图5配体- siRNA偶联物

2.3 扩大疾病目标

siRNA技术主要用于靶向蛋白质编码基因。然而最近的研究表明，ncRNAs在多种疾病中发挥着重要作用（图6）。因此，靶向ncRNA或许可以覆盖更多疾病，带来更好的治疗方案。另外，探索编码RNA和ncRNA之间的相互作用，不仅可以对疾病机制产生新的见解，还能进一步实现更有效的治疗干预。

除了在mRNA水平上调控基因表达外，siRNA技术还可以靶向表观遗传修饰，如DNA甲基化或组蛋白修饰，这些修饰在疾病的发生发展过程中起着至关重要的作用。通过调节表观遗传标记，有可能重编程基因表达模式和逆转疾病表型。

图6组蛋白修饰、DNA甲基化和非编码RNA构成三种不同的表观遗传调控机制

2.4 探索联合治疗

利用双靶向方法将siRNA与其他治疗药物联合使用，如化疗药物、抗体或免疫调节剂，有望提高疗效、克服耐药性和减少脱靶效应。

例如，目前正在研究VIR-2218（GalNAc-siRNA偶联物）和聚乙二醇-干扰素（PEG-IFNα）联用治疗乙型肝炎；siRNA JNJ-3989和核苷类抗病毒药物（NA）联用治疗慢性乙型肝炎患者；Pozelimab（补体c5靶向抗体）和Cemdisiran（GalNAc-siRNA偶联物）联用治疗重症肌无力和阵发性夜间血红蛋白尿（PNH）；Empaveli（一种环肽）和siRNA联用以降低Empaveli的治疗频率和/或提高治疗效果。

小结

我们正在见证一个新时代的曙光——RNA药物治疗。尽管存在挑战，siRNA仍然是一种很有前景的方法，能改变多种疾病的治疗方式。为了实现高效和安全传递、内吞体释放、体内药效，我们可以探索不同的配体-siRNA偶联物，扩展潜在的疾病靶点，挖掘新的修饰结构，以及开发联合疗法，以促进siRNA疗法的临床转化。相信跨多个领域的持续创新和协作最终会在RNAi治疗领域产生有价值的突破。

参考资料：

[1] https://doi.org/10.1016/j.molmed.2023.10.005